电喷雾电离质谱在多肽、蛋白质分子研究中的应用

【摘要】本博士论文的主要贡献为：应用电喷雾电离质谱,系统的对一种典型的九肽,及其与近二十种金属离子的非共价作用进行研究。分析了多肽-金属离子非共价结合的差异性,并通过自编程序计算,及一种新的分析体系,重点对复杂的含有多个金属离子的二价复合物碎片离子进行解析和归属,解释了在结合时金属离子对多肽构象的诱导变化作用,指出了不同离子选择性的氨基酸残基结合位点,及影响结合位点选择性的因素。随后,将研究对象扩展为一种典型的蛋白质分子,系统的研究了不同溶液环境对其分子构象的诱导变化作用,并初步研究了蛋白质分子的碎裂能量及其与金属离子的非共价结合。质谱分析方法在物质分析和成分鉴定中具有高灵敏度、高分辨率,是目前应用最为广泛的分析技术之一。电喷雾电离质谱能较为温和的产生带有多个电荷的气相离子,不仅可以得到化合物准确的分子量,还非常适合用于研究弱键相互作用。应用碰撞诱导解离技术,电喷雾电离质谱还可以用于结构分析、反应机理及非共价结合能力等方面。多肽和蛋白质是生命体中最重要的组成部分,它们的结构变化,往往伴随着生物学功能的变化,导致生命现象,如健康状态的改变等。近年来,随着蛋白质组学的蓬勃发展,关于多肽、蛋白质等生物分子的研究也受到了更为广泛的关注,相关研究已经被用于疾病预测及药物合成,并取得了重大的成就。电喷雾电离质谱的自身特性,己经使其无可争议的成为研究多肽、蛋白质分子最重要的工具之一蛋白质折叠佯谬问题,自从1969年被提出今日仍未破解,因此关于蛋白质分子构象变化的研究仍是一个重要的课题。此外,多肽-金属离子、蛋白质-金属离子非共价复合物也是蛋白质组学的重要组成部分,它们常常在生命过程中起到重要作用。因此,本文通过选择对金属离子诱导多肽构象变化这一课题为主要研究对象,通过碰撞诱导解离,详细研究了相关的结合及构象变化的过程。多肽是蛋白质分子的低级结构,可以为蛋白质分子的研究提供重要、可靠的基础信息。本文还讨论了多种不同的溶液环境对蛋白质分子构象的诱导变化作用,分析了影响蛋白质分子二级结构、三级结构的主要因素。最后,对蛋白质分子及其与金属离子的非共价作用做了初步的研究。全文共分六章,主要内容概述如下：第一章：绪论。本章概述了电喷雾电离质谱的基本原理和应用范围,指出运用该技术研究生物分子的结构和组成的优越性及重要意义。文中着重介绍了多肽和蛋白质分子的组成和分子结构,并阐述了pH值、溶剂组成、金属离子等因素均能诱导生物分子构象变化。应用电喷雾电离质谱可以分析生物分子的构象变化过程,研究生物分子与多种配体形成的非共价复合物。基于这些评述和总结,提出了本文的研究方向和研究思路。第二章：缓激肽分子离子及其碎片的研究。缓激肽是一种具有重要生理功能的九肽分子,几乎包含所有类型的氨基酸,并具有较为简单的空间结构,可以对其进行精细的构象研究。使用四种不同质谱仪器对缓激肽分子离子分别进行研究,并根据各自的性能选择了电喷雾四级杆-飞行时间质谱,详细研究了缓激肽分子离子及其碎片。首先获得三种缓激肽分子离子,再分别以一价离子和二价离子为母离子,进行二级质谱扫描,获得相应的子离子信息。根据理论计算,分析了可能的多肽碎片,再依照获得的碎片子离子质谱峰,分别对其进行了归属分析。改变碰撞能量为0-100eV,得到了两种离子的碎裂过程。二价离子能提供更多的结构信息,并着重分析了它的结构信息。一价缓激肽分子离子在碎裂过程中,需要更多的碰撞能量,并发生与二价离子相似的末端基团碎裂,但以y型离子为主,与二价复合物离子的碎片相比,不能提供足够的结构信息。第三章：缓激肽-碱金属离子非共价复合物的研究。碱金属离子参与了多种重要的生物过程,但其与多肽的结合位点选择及其诱导多肽构象变化过程仍存在争议。固定实验条件与第二章相同,运用单级质谱及串级质谱研究了缓激肽-碱金属离子非共价复合物。结果表明,碱金属与缓激肽可以产生两种主要的非共价复合物离子,即[BK+(2-n)H+nM]2+和l[BK+(1-n)H+nM]+(0≤n≤4)。不同碱金属的结合能力不同,按结合能力自强到弱排序即为：钠离子、锂离子、钾离子、铯离子和铷离子。创新性地对含有多个金属离子的复合物离子碎片进行分析,发现碱金属离子对于缓激肽分子离子上的氨基酸残基有选择性,且其二价复合物离子碎裂状况可以被分为三类：钠离子和锂离子,钾离子,铯离子和铷离子。碱金属的电负性、缓激肽分子离子的空间构象及碱金属离子的半径大小、质量数大小决定了它们的选择性和结合能力。碱金属离子的结合,也诱导了缓激肽的分子构象发生变化。第四章：缓激肽-过渡金属离子非共价复合物的研究。过渡金属离子因为含有不饱和的d电子,常常具有特殊的性质,此外过渡金属离子还存在毒性,因此是一种重要的研究对象。由于过渡金属离子的非共价结合能力往往较弱,因此相关研究较为薄弱。选择十三种包含同一周期、同族及多种价态的过渡金属离子,运用单级质谱及串级质谱研究了缓激肽-过渡金属离子非共价复合物。结果表明,一价离子的结合与碱金属相同,二价离子则略有不同,形成[BK+(1-2n)H+nM]+和[BK+(2-2n)H+nM]2+(0≤n≤4),三价离子的结合方式最为特殊,其二价复合物离子可以与两个缓激肽分子离子相连,但非常不稳定。第一过渡周期金属离子的结合可以被分为两类,Cu2+与其余四种不同金属离子。过渡金属离子都可以结合在多肽的碎片上。PtCl4可以以团簇形式进行结合,最多可以结合六个氯。MoCl3和RhCl3则均不能和缓激肽分子离子发生结合。其中,PtCl4和MoCl3由于存在配位键,对缓激肽分子离子的质谱信号有抑制作用。过渡金属离子的结合位点选择性主要由d轨道电子决定。第五章：肌血球素构象变化的研究。肌血球素是重要的储氧物质,为了研究溶液环境对肌血球素分子构象的影响作用,分别固定了溶液的pH值及溶剂组成,应用电喷雾电离质谱,并以圆二色谱、紫外-可见光谱等技术进行辅助,讨论了这些因素对肌血球素分子构象的影响。当pH=4.0时,我们将醇类的体积分数固定为30%,改用六种不同的醇类诱导肌血球素分子构象变化,结果表明醇类分子的不同直接影响肌血球素分子的构象、铁离子的配位和电子自旋态。当固定溶剂为甲醇时,我们改变溶液的pH值分别为11.0,11.4,12.0,观察不同体积分数(0%、10%、30%、50%、70%、90%)的甲醇诱导肌血球素分子构象变化。结果表明,pH值诱导蛋白质分子的二级结构变化,甲醇分子的含量诱导蛋白质分子的三级结构变化。pH=11.4,30%甲醇含量的溶液条件是一个肌血球素变性的临界点,并带来肌血球素分子内铁离子的配位情况及电子自旋态的变化。此外,初步研究了肌血球素的碎裂能量和肌血球素-金属离子非共价复合物,发现hMb往往直接发生辅基的脱落,而aMb的碎裂模式较hMb而言更为复杂,其中aMb15+的能量势垒最低。肌血球素可以在酸性溶液中和多种金属离子发生非共价结合。第六章：总结与展望。对全文取得的研究成果进行了总结和分析,同时也指出了目前研究工作中存在的不足之处,并提出了相应的改进方案。
【作者】姜丹；
【导师】丁传凡；
【作者基本信息】复旦大学，物理化学，2011，博士
【关键词】多肽；蛋白质；电喷雾电离质谱；缓激肽；金属离子；诱导碰撞解离；肌血球素；

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